• Тесты на коронавирус
все по теме

Как устроены тесты на коронавирус: ПЦР, антитела, CRISPR

Почему ни одна из существующих технологий тестирования не способна обеспечить ни точность, ни массовость

Эпидемия нового коронавируса SARS-CoV-2 поразила все континенты.

К 1 июня 2020 года в мире было выявлено почти 6,2 млн случаев заражения. Инфекция распространяется быстро, ее переносчиками становятся люди, которые никогда не посещали очаги заболевания.

Почему так получилось?

У COVID-19 есть две отличительные особенности, которые делают его чрезвычайно опасным:

  • Продолжительный инкубационный период, на протяжении которого человек заразен и представляет угрозу для окружающих. По информации ВОЗ, он длится от 5 до 14 дней. В редких случаях инкубационный период может достигать 24 дней.
  • Часть зараженных переносят болезнь бессимптомно, в то же время являясь ее распространителями. Центр по контролю и профилактике заболеваний США оценивает долю таких пациентов в 25-30% от общего числа.

Создание вакцины займет много времени, до тех пор массовое тестирование — важнейший способ борьбы с распространением COVID-19. Кому-то своевременное тестирование может спасти жизнь. Выявление бессимптомных носителей поможет уберечь их близких и предотвратить дальнейшую передачу болезни. Из этого материала вы узнаете, какие тесты на коронавирус существуют, как они работают и стоит ли им доверять.

ПЦР-тесты

История развития метода ПЦР

Как они проводятся

Тест с использованием полимеразной цепной реакции способен установить наличие вируса в организме пациента. Для анализа используют образец ДНК вируса, полученный из носоглотки, носа или рта заболевшего. Изучение изолированных фрагментов ДНК практически невозможно, поэтому для проведения теста необходимо увеличить объем имеющегося образца ДНК методом (копирования).

Из образца извлекается нуклеиновая кислота, содержащая генетический материал вируса. В пробирку с фрагментом ДНК добавляется амплификационная смесь, включающая все необходимое для синтеза и репликации молекулы ДНК (праймеры, нуклеотиды, ДНК-полимеразу, водный раствор). Затем пробирка нагревается в автоматизированном термостате, происходит денатурация фрагмента ДНК — он распадается на две цепочки.

Далее температура понижается и при более низкой температуре к фрагменту ДНК присоединяются праймеры (цепочки нуклеотидов, соответствующие началу и концу копируемого отрезка). Затем температура снова повышается и фермент под названием ДНК-полимераза заполняет недостающие участки. На основе денатурированного образца ДНК происходит репликация двух идентичных молекул ДНК.

Операция нагревания и охлаждения многократно повторяется до тех пор, пока объем образца не будет достаточным для анализа. Процесс занимает несколько часов. Если неверно установить температуру, праймеры могут не образовать прочную связь или присоединиться к цепочке ДНК в неверном месте. Когда образец достигнет достаточного объема, его можно будет проанализировать — добавить флуоресцентный краситель, который светится только в присутствии ДНК возбудителя.

Расходные материалы и оборудование для ПЦР

Насколько точны ПЦР-тесты?

ПЦР-тесты на коронавирус наиболее распространены и проводятся повсеместно. Однако чувствительность этих тестов недостаточно изучена и описана в медицинской литературе, а их эффективность часто ставится под сомнение — врачи во всем мире получают ложноотрицательные результаты тестирования.

Опасения врачей складываются из нескольких факторов.

  • Тесты были созданы в короткие сроки сотнями лабораторий и производителей, которые, в виду срочной необходимости начать тестирование, не были проверены должным образом.
  • На результатах тестирования может сказаться нехватка лабораторных материалов.
  • Длительный инкубационный период инфекции и сложность получения качественного образца.

Во-первых, важную роль играет место забора. Вирус передается воздушно-капельным путем, когда зараженный человек выдыхает, чихает или кашляет. Лучше всего поддаются тестированию образцы, собранные из нижних дыхательных путей. Далее идут носоглотка и пространство над мягким небом в задней части носа. Мазок из носа или рта имеет меньшую концентрацию вируса, а значит — чувствительность теста будет ниже. Чем хуже образец, взятый медицинским работником, тем выше вероятность ложноотрицательного теста.

Обычно мазок берется длинной ватной палочкой, которая проникает глубоко и достигает слизистой оболочки носоглотки. Процедура довольно неприятная, качественный образец сложно получить даже обученному медработнику. А широкомасштабное тестирование приводит к нехватке персонала, так что образцы могут собирать неквалифицированные сотрудники. Недостаточная концентрация генетического материала вируса в образце пациента также может снизить чувствительность, тест даст ложноотрицательный результат.

Во-вторых, важно время забора образца, поскольку концентрация вируса в носоглотке меняется в зависимости от стадии заболевания: больные на ранней стадии заражения до проявления симптомов и поздней стадии заражения, когда симптомы ослабевают, с большей вероятностью могут получить ложноотрицательный результат теста.

Но даже на пиковой стадии вероятность сделать успешный забор достаточно низка. Согласно исследованию, только забор бронхоальвеолярной жидкости дает 93% точности. Мокрота — уже 72%, мазок в носу — 63%, а мазок в глотке — лишь 32%.

На качество влияют также условия транспортировки образца и погрешности в процессе тестирования. Из-за большой нагрузки лаборатории могут испытывать дефицит необходимых для тестирования химикатов и пытаться подобрать им замену. Как видите, на каждой стадии тестирования есть множество факторов, которые могут привести к ложноотрицательному результату.

Тесты на антитела

Как они проводятся

ПЦР-тесты определяют наличие инфекции в организме на момент тестирования и используются для постановки диагноза. Тест на антитела определяет наличие не самого вируса, а иммунной реакции организма в ответ на его вторжение. Он не поможет поставить диагноз больному, но покажет, болел ли человек ранее. Антитела вырабатываются в крови через 4-7 дней после заражения и сохраняются в течение нескольких месяцев. Для чего нужен тест, если он не помогает диагностировать пациентов? Он позволяет оценить реальные масштабы распространения COVID-19, поскольку у многих носителей болезнь протекает бессимптомно. А переливание богатой антителами к вирусу SARS-CoV-2 крови может применяться для лечения тяжелобольных пациентов

Существует несколько классов антител, которые вступают в действие на разных стадиях иммунного ответа(иммуноглобулины IgM, IgG, IgA, IgD, IgE). 

  • Самый простой и быстрый тест всего за 15 минут выявляет присутствие иммуноглобулинов IgM (первым синтезируется в организме) и IgG (дольше всего сохраняется в организме, отвечает за предотвращение повторного заражения). Для тестирования используется капля крови из пальца, которая помещается на картридж, а после промывается солевым раствором. Быстрый тест COVID-19 IgM/IgG с определением результата за 15 минут во многом схож с домашним тестом на беременность, его может выполнить непрофессионал.
  • В случае тестирования в лаборатории используется иммуноферментный анализ (ИФА-тест). Белок SARS-CoV-2 помещается в планшет с лунками, туда же добавляется сыворотка крови. Если в пробе пациента присутствуют необходимые антитела, они связываются с белком вируса и образуют иммунный комплекс. Наличие иммунного комплекса покажет лабораторный фермент, способный менять цвет. Для получения результата, в зависимости от варианта проведения ИФА-теста и количества антител, получения результата требуется несколько часов.

Насколько эффективны тесты на антитела?

Тесты на антитела могут давать ложный результат, как и ПЦР-тесты. Во-первых, это может произойти в результате лабораторной ошибки. Для создания теста необходимо правильно подобрать вирусный белок, иначе тестирование окажется бесполезным. Во-вторых, обнаруженные антитела могут вовсе не иметь отношения к COVID-19, а быть реакцией на другие коронавирусы, вызывающие простуду

Ученые, которые участвовали в проверке быстрых тестов COVID-19 IgM/IgG, сомневаются в их эффективности. В основном они предназначены для домашнего использования пациентами с более мягкими симптомами коронавируса, однако способны определить наличие антител у таких пациентов лишь с вероятностью 50-60%.

Ни у научного сообщества, ни у ВОЗ пока нет достоверной и надежной информации о том, что антитела формируются у всех переболевших, и нет информации, как долго будет сохраняться этот иммунитет. Если иммунитет будет длительным, то переболевшие не заразятся повторно до конца эпидемии или появления вакцины. Но если иммунитет сохранится лишь на несколько месяцев, то после исчезновения антител из организма можно снова заболеть. Сколько в организме сохраняются антитела — никто не знает, а значит, нет оснований полагать, что излечившиеся от коронавируса люди могут без риска для здоровья вернуться к привычному образу жизни. 

CRISPR-тесты

Описанные методы тестирования на COVID-19 имеют ряд проблем. В большинстве случаев тестирование занимает много времени, а точность оставляет желать лучшего. Тест на антитела не способен определить заражение на ранней стадии, а ПЦР-тест требует значительной концентрации генетического материала вируса в пробе. 

Решением этих проблем могут стать тесты нового поколения, основанные на CRISPR-Cas технологии, разработкой которых занимаются ученые Калифорнийского университета в Сан-Франциско и Mammoth Biosciences. Разработчики обещают, что новый тест будет занимать всего 35-40 минут, а для его проведения не потребуется сложно дорогостоящего оборудования, как для ПЦР-тестов. Точность CRISPR-тестов — 95% для положительных результатов и 100% для отрицательных результатов. 

CRISPR-Cas технология была адаптирована из естественных защитных механизмов бактерий и архей. CRISPR — это особые участки ДНК, а Cas — белок, который действует как пара молекулярных ножниц, способных разрезать нити ДНК. Когда вирус атакует клетку, CRISPR-молекула при помощи Cas-белков разрезает и измельчает его. В случае более сложных организмов белковые ножницы CRISPR-Cas систем позволяют «редактировать» гены. 

Для CRISPR-теста используется оральный или назальный мазок пациента. Он помещается в пробирку с CRISPR-Cas системой и другими необходимыми химикатами. Система CRISPR-Cas распознает специфические генетические последовательности вируса и вырезает их из ДНК бактерий. Разрез высвобождает флуоресцентные молекулы, которые изменят цвет контрольной полоски и покажут наличие вируса

В конечном итоге разработчики рассчитывают создать портативный набор для тестирования с одноразовыми картриджами, который можно использовать в домашних условиях. Необходимые для теста реагенты достаточно широко используются и стоят недорого. Ученые Калифорнийского университета рассчитывают, что им удастся снизить стоимость CRISPR-теста до $1 для клинического лабораторного исследования и до $5 для домашнего набора. Почему CRISPR-тесты заслуживают больше доверия, чем ПЦР-тесты? Тестирование проводится при постоянной температуре с использованием простых реагентов, сложное оборудование не требуется, а значит — меньше шансов на ошибку. 

Что делать, если на тесты полагаться нельзя?

ПЦР-тесты и тесты на антитела к COVID-19 проходят миллионы людей. Поэтому даже при чувствительности теста на коронавирус в 90% ложноотрицательные результаты создают слишком высокие риски для общества. Качество ПЦР-тестов во многом зависит стадии заражения и концентрации вируса в организме пациента, от медработника, который взял мазок, от курьера, который доставил его в лабораторию и от лаборанта, который провел анализ. На каждом этапе может быть допущена ошибка, которая приведет к ложному результату. ИФА-тест может показать наличие антител к другому вирусу. Пациент будет вдвойне уязвим, если будет ошибочно считать, что обладает иммунитетом к COVID-19. CRISPR-тесты более надежны и просты в использованию. К сожалению, их пока не производят. 

«Если у пациентов наблюдаются классические симптомы COVID-19, но тесты показывают отрицательный результат — у них все еще COVID-19. Ничего другого просто не может быть в Нью-Йорке в 2020 году», — говорит врач Джереми Сперлинг, глава отделения скорой помощи в Jacobi Medical Center в Бронксе. Врачи призывают использовать компьютерную томографию, которая покажет наличие вируса в легких, даже если тест даст отрицательный результат. Если вы здоровы и у вас не наблюдается симптомов, продолжайте использовать средства защиты и соблюдать социальную дистанцию. Так вы защитите себя и других.

Узнавайте первым!

Подпишитесь на нашу рассылку. Получайте новые статьи первым. Без спама

Комментарии для сайта Cackle

Как долго нужно изолироваться после выздоровления

Cледующая статья